• Document: LA PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL OU LA "TAQMAN"
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 Généthon, 2001 Evaluation in vivo http://www.genethon.fr LA PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL OU LA "TAQMAN" I- Terminologie Le terme TaqMan est souvent utilisé par abus de langage pour désigner : - la technique de PCR quantitative par détection en temps réel de la fluorescence - l'appareil 7700 de chez Perkin Elmer. (on dit alors plutôt "le TaqMan" ) Il est important de bien distinguer l'appareil de mesure du type de réaction chimique utilisé: Le mot "TaqMan" est dérivé des deux mots : Taq polymérase et de PacMan ! En effet, la Taq polymérase possède une activité exonucléase 5'->3' permettant de dégrader tout oligonucléotide « se trouvant sur son passage ». Le terme TaqMan est déposé et concerne la chimie « TaqMan » ou la sonde « TaqMan ». La chimie TaqMan est une PCR quantitative qui utilise une sonde spécifique oligonucléotidique marquée par deux fluorophores dont l’un est quenché par l’autre dit Reporter. C’est une sonde TaqMan. La dégradation de cette sonde au cours de chaque passage de la Taq sera accompagnée d’une augmentation de fluorescence du Reporter qui sera mesurée au cours de chaque cycle de PCR. II- Modélisation et quantifications de la PCR La PCR correspond à une amplification d’un fragment d’ADN spécifique délimité par des « amorces ». L’évolution de cette amplification peut être représentée par une courbe dont l’allure est celle d’une sigmoïde (Figure 1) Cette courbe peut être divisée en 2 phases. La première phase correspondant à une amplification exponentielle qui est modélisable. La quantité de produit de PCR obtenue à chaque moment de cette phase est directement fonction du nombre de copies initiale du fragment d’ADN amplifié. En revanche, la phase de plateau correspond à un ralentissement de l’amplification qui peut être du à l’épuisement des différents réactifs de la PCR comme les amorces. Cette phase est difficilement modélisable d’autant plus qu’elle n’est souvent pas reproductible. La première phase est par contre relativement facilement modélisable. Soit: - N0 : le nombre de copies initiales, - Nc : le nombre de copie au cycle c -E : l’efficacité de la PCR N1=N0.(1+E) N2=N1.(1+E) ... Nc=N(c-1).(1+E) ------------------ Nc=N0.(1+E)c © Tous droits de traduction, d'adaptation et de reproduction par tous procédés réservés pour tous pays  Généthon, 2001 Evaluation in vivo http://www.genethon.fr Courbe d’amplification d’une réaction Fluorescence (unité arbitraire) échelle linéaire Nombres de cycles échelle logarithmique . Log (fluo.) (unité arbitraire) Nombres de cycles Figure 1 : Courbe d’amplification d’une réaction de PCR Représentation d’une amplification par PCR d’un fragment d’ADN. L’axe des abscisses correspond aux cycles de la PCR. L’axe des ordonnées correspond à la quantité du produit amplifié. La partie en vert (de 1 à 29 cycles) correspond à la phase exponentiellecontient une phase bruit de fond (de 1à 21 cycles) et une phase mesurable en bleu (de 21 à 29 cycles). La partie en rouge (de 29 à 49 cycles) correspond à la phase plateau. 2  Généthon, 2001 Evaluation in vivo http://www.genethon.fr Exemple particulier : Si E=100%, à chaque cycle, le nombre de copies double : Nc=N0.2c A partir du tronçon de la courbe correspondant à la phase “ exponentielle détectable ” il est théoriquement possible d’extrapoler le paramètre N0. Cependant, dans la pratique il n’est pas facile d’obtenir une telle courbe et encore moins une courbe dont l’unité de l’ordonnée soit en nombre de copies. Il n’est alors pas possible d’en déduire directement le nombre de copies initiales. Il faut impérativement inclure à chaque expérience des échantillons standards de concentration connue. III. La PCR quantitative : relative vs absolue La PCR quantitative consiste à comparer au moins deux échantillons. Un échantillon sert de référence et la quantification des autres sera faite relativement à

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