• Document: MANUAL DE LA ASIGNATURA INMUNOFISIOLOGÍA - Práctica 4: Fraccionamiento de inmunoglobulinas con sulfato de amonio
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MANUAL DE LA ASIGNATURA INMUNOFISIOLOGÍA - Práctica 4: Fraccionamiento de inmunoglobulinas con sulfato de amonio Práctica 4 Fraccionamiento de inmunoglobulinas mediante precipitación en sal Semestre B 2010 Introducción Las moléculas de proteínas pueden reaccionar unas con otras, también con iones de carga opuesta y con agua por ser ésta un dipolo, ya que una proteína tiene muchos grupos correspondientes a sus cadenas laterales, cargados positiva o negativamente (dependiendo del pH del medio en que se haya disuelta). Tendremos por lo tanto, interacción proteína- proteína, proteína- agua, proteína-ión. La solubilidad de una proteína depende del balance relativo entre las interacciones proteína- solvente, lo cual tiende a mantenerla en solución y de las interacciones proteína-proteína, las cuales hacen que la proteína se agregue y precipite. La fuerza iónica de las soluciones es de particular importancia para especificar cual de estos tipos de interacciones predomina. Las proteínas son solubles en un medio acuoso debido a que sus aminoácidos que contienen grupos hidrofílicos, expuestos sobre a superficie de la proteína, interactúan con las moléculas de agua del medio, formando una capa de solvatación. Estos grupos hidrofílicos son proporcionados por los aminoácidos básicos (arginina, histidina y lisina), ácidos (aspartato y glutamato) y neutros (asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y cisteína). Cualquier compuesto que interfiera con estas interacciones entre los grupos laterales de los aminoácidos hidrofílicos de la proteína y las moléculas de agua, reducirá la solubilidad de la proteína. A medida que las interacciones de la proteína con el agua decrece, las interacciones entre proteína-proteína se vuelven mas importantes, y la proteína se agrega, y precipita de la solución. Si la interacción proteína-proteína es grande y la interacción proteína-agua es pequeña, la proteína será insoluble. Si la interacción proteína - agua es alta, entonces la proteína tenderá a solubilizarse (altamente solvatada). Cualquier condición que aumente la interacción proteína- proteína o disminuya la interacción proteína-agua disminuye la solubilidad de las proteínas (le quita la capa de solvatación). Un variado número de métodos bioquímicos pueden ser utilizados para reducir las interacciones hidrofílicas y propiciar la precipitación selectiva de proteínas, tales como: • Fraccionamiento de proteínas por salado. • Precipitación selectiva con un solvente inorgánico que reduce el agua de hidratación y también reduce la constante dialéctica de la solución. El fraccionamiento con etanol es comúnmente utilizado para separar fracciones de proteínas del plasma sanguíneo • Precipitación selectiva utilizando polímeros no-iónicos como el polietilenglicol, el cual opera reduciedo la disponibilidad de las moléculas de agua, así como interactuando con algunas proteínas de la mezcla En el fraccionamiento por salado, grandes cantidades de una sal muy soluble agregada a una solución de proteínas, disminuye la interacción proteína-agua porque le quita la capa de solvatación, predominará la interacción proteína-proteína y se producirá la precipitación. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para cualquier proteína, lo MANUAL DE LA ASIGNATURA INMUNOFISIOLOGÍA - Práctica 4: Fraccionamiento de inmunoglobulinas con 2 sulfato de amonio que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas. Comúnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad. La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de proteínas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas, entonces un exceso de agua, por encima del punto de precipitación, permite solubilizar nuevamente las proteínas. Si este proceso se lleva a cabo a baja temperatura (alrededor de 4ºC), las proteínas precipitan sin que se desnaturalicen. Luego, las proteínas precipitadas pueden separarse mediante centrifugación y posteriormente pueden ser re-disueltas en una solución buffer y dializada por varias días para eliminar el sulfato de amonio. El método de precipitación con sulfato de amonio es uno de los más utilizados para preparar fracciones crudas de inmunoglobulinas a partir del suero. Las fracciones crudas contienen todas los isotipos de inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgA, IgE IgD), además de otras proteínas contaminantes, tales como, las β globulinas, ciertas proteínas de alto peso molecular, así como proteínas atrapadas en el precipitado floculento. La concentración de sulfato de amonio a la cual los anticuerpos precipitan varía entre las especies. La mayoría de los anticuerpos de conejo precipitan en un 40% de saturación, mientras que los anticuerpos de ratón necesitan de 45 a 50% de saturación. Precipitaciones con sulfato de

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